單克隆抗體發(fā)展歷史

1.何謂單克隆抗體

單克隆抗體（Inonoclonal antihy , McA ）是指一個(gè)B 淋巴細(xì)胞經(jīng)無(wú)性繁殖成為一個(gè)細(xì)胞系，即一個(gè)克隆所分泌的針對(duì)單一抗原決定簇而組成均一的抗體。

單克隆技術(shù)是近20 年來(lái)發(fā)展起來(lái)的生物高科學(xué)技術(shù)，早在1975 年劫Her 和呱玩ein 便建立了B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，并由此而榮獲1984 年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?？贵w技術(shù)的發(fā)展歷經(jīng)3 個(gè)階段；1975 年B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的建立，使第一代抗體（血清多克隆抗體）發(fā)展到了第二代抗體（單克隆抗體）。

單克隆抗體的出現(xiàn)對(duì)促進(jìn)生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展起著極為重要的作用；進(jìn)人so 年代，基因工程技術(shù)有了迅速發(fā)展，并應(yīng)用到抗體技術(shù)領(lǐng)域，尤其是卯年代抗體庫(kù)技術(shù)的建立和完善，使抗體技術(shù)發(fā)展到第三代抗體（基因工程抗體）。B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)是將能長(zhǎng)期在體外增殖的骨髓瘤細(xì)胞與能產(chǎn)生抗體的B 淋巴細(xì)胞融合成為雜交瘤細(xì)胞（hybridOInacell ） ，使其保留兩親代細(xì)胞的特性，即骨髓瘤細(xì)胞在體外長(zhǎng)期增殖的特性和B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的特性。

這種雜交瘤細(xì)胞可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，不斷地分泌出大量的特異性抗體。由于骨髓瘤細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞多來(lái)源于同品系的BIc 小鼠，故又稱鼠源性B 淋巴細(xì)胞瘤雜交技術(shù)。

目前，用于免疫學(xué)檢測(cè)的單克隆試劑種類很多，其中小鼠抗人CD 系列單克隆抗體試劑便有近百種，此外，還有小鼠抗人班產(chǎn)系列單克隆抗體試劑、小鼠抗人殆系列單克隆抗體試劑、小鼠抗人細(xì)胞因子單克隆抗體試劑、小鼠抗人生長(zhǎng)因子系列單克隆抗體試劑、小鼠抗人腫瘤相關(guān)抗原單克隆抗體試劑、小鼠抗酶單克隆抗體試劑及小鼠抗人中間絲單克隆抗體試劑等300 余種。目前，絕大多數(shù)單克隆抗體來(lái)源于小鼠。

鼠單克隆抗體為異種蛋白，用于人體后?？梢虍a(chǎn)生人抗鼠抗體而降低單克隆抗體的治療效果，甚至因形成免疫復(fù)合物而發(fā)生bian態(tài)反應(yīng)和嚴(yán)重的血清病，從而限制了在人體的治療應(yīng)用。為克服鼠單克隆抗體的諸多弊病，近年來(lái)，通過(guò)人一鼠雜交瘤技術(shù)、人一人雜交瘤技術(shù)和EBV 轉(zhuǎn)化/E BV 轉(zhuǎn)化雜交瘤等技術(shù)，已研制出人源性單克隆抗體。

目前，由于用上述方法獲得的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，抗體分泌水平較低，性能不穩(wěn)定，且陽(yáng)性克隆在傳代過(guò)程中極易丟失等原因，人源性單克隆抗體的制備遇有許多困難，致使許多單克隆抗體治療研究尚處實(shí)驗(yàn)階段。近10 年來(lái)，基因工程抗體的研究有了較快發(fā)展。

基因工程抗體是指利用重組DNA 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體基因進(jìn)行加工改造或重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后所表達(dá)的抗體分子。常用于轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞有真核細(xì)胞系統(tǒng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞和原核細(xì)胞系統(tǒng)的大腸桿菌等。

基因工程抗體的種類有嵌合抗體（chimerioantiy ）、改型抗體（hay , RAb ）、原核克隆抗體（oliclonal antihes ）、噬菌體抗體（phanti des ）等。近年來(lái)，有關(guān)改型抗體的研究有了很大進(jìn)展。

改型抗體是在嵌合抗體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。改型抗體是利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變（v ）區(qū)中互補(bǔ)決定簇（plemento ' ty 一dste ng region , CDR ）序列改換成鼠源單抗CDR 序列，從而重構(gòu)建成既具有鼠源性單抗特異性，又能保持抗體親合力的人源化抗體。

改型抗體又稱重構(gòu)型抗體（hay ） ，因其主要涉及cDR 的“移植”，故又稱為cDR 移植抗體（cDR ing antihy ）。這種重構(gòu)的改型抗體能最大限度地克服鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)的免疫原性，并且對(duì)靶抗原又有較高的特異性和親合力，因此具有較大的實(shí)用價(jià)值。

改型抗體的構(gòu)建方法有多種，目前較常采用PCR 技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建等用PCR 誘變重疊法，使鼠CDR 序列取代人V 區(qū)相應(yīng)序列，經(jīng)數(shù)輪PCR 擴(kuò)增便可獲得高產(chǎn)量的正確裝配序列。PCR 技術(shù)可大大簡(jiǎn)化改型抗體的構(gòu)建。

目前已構(gòu)建30 余種針對(duì)不同抗原的改型抗體，有些已應(yīng)用于臨床診斷和治療，并取得令人滿意的效果，如用于消除腫瘤、延長(zhǎng)器官生存期，改善全身性脈管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感染性疾病及免疫紊亂性疾病的臨床癥狀等。

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2.基因工程發(fā)展的歷史背景

20世紀(jì)70年代初，利用重組DNA實(shí)驗(yàn)將哺乳動(dòng)物基因?qū)爰?xì)菌體內(nèi)，并表達(dá)成功，開(kāi)創(chuàng)了生物技術(shù)制藥工業(yè).短短20余年時(shí)間就獲得了諸如人胰島素、人生長(zhǎng)素、α-干擾素、白細(xì)胞介素-2等多種生物技術(shù)藥品，并已上市.1997年美國(guó)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物、疫苗和注射用單克隆抗體達(dá)39種，2004年已超過(guò)150種.自20世紀(jì)70年代基因工程誕生以來(lái)，最先應(yīng)用基因工程技術(shù)且目前活躍的研究領(lǐng)域便是醫(yī)藥科學(xué)，基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展是人們已能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì).。

3.分子生物學(xué)的發(fā)展歷程有哪些

分子生物學(xué)的發(fā)展大致可分為三個(gè)階段。

（一）準(zhǔn)備和醞釀階段19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破。

確定了蛋白質(zhì)是生命的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。19世紀(jì)末Buchner兄弟證明 酵母 無(wú)細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。

20世紀(jì)20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、共同酶、細(xì)胞色素C、肌動(dòng)蛋白等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)生命的許多基本現(xiàn)象（物質(zhì)代謝、能量代謝、消化、呼吸、運(yùn)動(dòng)等）都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系，可以用提純的酶或蛋白質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出來(lái)。

在此期間對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)也有較大的進(jìn)步。1902年EmilFisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發(fā)展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個(gè)多肽分子――胰島素A鏈和B鏈的氨基酸全序列分析。

由于結(jié)晶X-線衍射分析技術(shù)的發(fā)展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)模型。所以在這階段對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認(rèn)識(shí)。

確定了生物遺傳的物質(zhì)是DNA。雖然1868年F.Miescher就發(fā)現(xiàn)了核素（nuclein），但是在此后的半個(gè)多世紀(jì)中并未引起重視。

20世紀(jì)20-30年代已確認(rèn)了自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成。由于當(dāng)時(shí)對(duì)核苷酸和堿基的定量分析不夠精確，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的結(jié)果，因而間長(zhǎng)期認(rèn)為DNA結(jié)構(gòu)只有“四核苷酸”單位的重復(fù)，不具有多樣性，不能攜帶更多的信息，當(dāng)時(shí)對(duì)攜帶遺傳信息的侯選分子更多的是考慮蛋白質(zhì)。

40年代以后的實(shí)驗(yàn)事實(shí)使人們對(duì)核酸的功能和結(jié)構(gòu)兩方面的認(rèn)識(shí)都有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA;1952年S.Furbery等的X-線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)；1948-1953年Chargaff等用新的層析和電泳技術(shù)分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數(shù)據(jù)，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff規(guī)則，為堿基酸對(duì)的DNA結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)打下了基礎(chǔ)。

（二）現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開(kāi)創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金。DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的最深刻意義在于：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；提出堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。

在些期間的主要進(jìn)展包括：遺傳信息傳遞中心法則的建立。在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。

其后在1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型；1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開(kāi)始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對(duì)真核DNA聚合酶特性做了分析研究；這些都逐漸完善了對(duì)DNA復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識(shí)。在研究DNA復(fù)制將遺傳信息傳給子代的同時(shí)，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質(zhì)過(guò)程中起著中介作用的假說(shuō)。

1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜增色證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)；逐步闡明了RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)理。在此同時(shí)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。

50年代初Zameik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)微粒體（microsome）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位；1957年Hoagland、Zameik及Stephenson等分離出tRNA并對(duì)它們?cè)诤铣傻鞍踪|(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中mRNA與核糖體的結(jié)合；1965年Holley測(cè)出了 酵母 丙氨酸tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識(shí)了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過(guò)程。上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)基本理論體系。

1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶，又進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了遺傳信息傳遞的中心法則。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

1956-58年anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來(lái)確定的。1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細(xì)胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別，使人們對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)影響功能有了深刻的印象。

與此同時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)研究的手段也有改進(jìn)，1969年Weber開(kāi)始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量；60年代先后分析得血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)。

4.生物制劑的發(fā)展簡(jiǎn)史

傳統(tǒng)生物技術(shù)發(fā)展階段

公元前6000年蘇美爾人釀造啤酒

公元前4000年埃及人發(fā)酵面包

我國(guó)殷朝制醬、周朝制醋……

特點(diǎn)：自然發(fā)酵，全憑經(jīng)驗(yàn)

近代生物技術(shù)階段

1673年荷蘭微生物學(xué)家安東·列文虎克發(fā)明簡(jiǎn)式高倍（300倍）顯微鏡，發(fā)現(xiàn)了微生物。

1857年法國(guó)科學(xué)家巴斯德證明了發(fā)酵原理。

1928年英國(guó) Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素。

1940年英國(guó)弗洛里和錢(qián)恩分離出青霉素。

現(xiàn)代生物技術(shù)

1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

1973年 建立DNA重組技術(shù)

1975年 建立單克隆抗體技術(shù)

1978年 利用大腸桿菌表達(dá)出胰島素

1988年 PCR技術(shù)出現(xiàn)

1997年 英國(guó)克隆多利羊

1998年 RNA干擾技術(shù)

5.單克隆抗體的全人源單克隆抗體

單克隆抗體的發(fā)展經(jīng)歷了四個(gè)階段，分別為：鼠源性單克隆抗體、嵌合性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體。

全人源單克隆抗體：其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體制備的相關(guān)技術(shù)主要有：人雜交瘤技術(shù)、EBV 轉(zhuǎn)化 B 淋巴細(xì)胞技術(shù)、噬菌體顯示技術(shù)（phage display）、轉(zhuǎn)基因小鼠抗體制備技術(shù)（tran

sgenic mouse）和單個(gè)B細(xì)胞抗體制備技術(shù)等。

由人源化和全人源抗體制備的人源化和全人源抗體藥物因其具有高親和力、高特異性、毒副作用小的特點(diǎn)，克服了動(dòng)物源抗體及嵌合抗體的各種缺點(diǎn)，已經(jīng)成為了治療性抗體藥物發(fā)展的必然趨勢(shì)。阿達(dá)木單抗作為生物單抗藥物，在療效和技術(shù)門(mén)檻方面難以挑戰(zhàn)；另外，越來(lái)越多的醫(yī)生在治療類風(fēng)濕時(shí)選皮下注射給藥的劑型，不需要注射過(guò)程和費(fèi)用，雖然與依那西普的對(duì)比臨床試驗(yàn)還未出來(lái)，但是人們普遍認(rèn)為阿達(dá)木單抗的療效更好。